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BACTOX, un rápido ensayo biológico que utiliza protozoos Para evaluar la toxicidad de bacterias ABSTRACTO Un nuevo tipo de ensayo de toxicidad en base a los protozoos Tetrahymena piriformis se ha desarrollado para evaluar la toxicidad global de cepas bacterianas dado como presa. Esta prueba simple y rápida es capaz de detectar bacterias productoras de sustancias tóxicas, que pueden presentar un riesgo biológico. También se puede utilizar para la evaluación del riesgo de microbios diseñados para la liberación intencional. Muchos ensayos de toxicidad para determinar los efectos agudos y crónicos están disponibles para el seguimiento y la evaluación del riesgo de nuevos productos químicos y xenobióticos o para la evaluación de la toxicidad de los contaminantes ambientales. La elección del organismo más adecuado para tales bioensayos se determina por las sustancias que deben evaluarse y la sensibilidad del organismo (5). Por ejemplo, las líneas celulares de ingeniería se están convirtiendo en una herramienta para el cribado de análogos de la hormona (8), y las algas son eficaces para el ensayo de la fitotoxicidad de los compuestos que actúan sobre la ruta fotosintética (16). Los contaminantes ambientales y sustancias tóxicas son evaluados con diversos organismos (1. 7. 9. 11. 15. 18), incluyendo protozoos, predominantemente Tetrahymena (2. 7, 13. 14. 21). Por lo general, los organismos de ensayo están expuestos a productos químicos individuales o a los contaminantes ambientales presentes en el agua, pero no a las bacterias enteras. Las bacterias participan cada vez más en muchas aplicaciones biotecnológicas, incluyendo la producción de sustancias bioactivas, control de plagas, y la protección de las plantas. Para proporcionar los datos toxicológicos de estas bacterias como lo requiere, por ejemplo, autoridades reguladoras (10), las pruebas de toxicidad habituales no son aplicables ya que son ensayos basados en productos químicos en solución. No bioensayo para evaluar la toxicidad global de los microorganismos ha sido descrita hasta ahora. Se presenta un nuevo tipo de bioensayo semicuantitativa para evaluar la toxicidad bacteriana en general basado en los protozoos Tetrahymena piriformis alimentados con bacterias naturales o modificadas genéticamente. Las muertes entre los protozoos son monitoreados, y la tasa de mortalidad se utiliza para evaluar la toxicidad de la bacteria. T. piriforme fue elegido porque es una norma reconocida para las pruebas de toxicidad (4. 6. 13-15. 17). El propósito de la prueba BACTOX es la detección de la toxicidad global de cepas subrepticios que sintetizan metabolitos tóxicos secundarios (sustancia tóxica) y que pueden constituir un riesgo biológico. Su finalidad no es la detección de toxinas dirigidas específicamente, ya que las bacterias pueden producir varios metabolitos tóxicos simultáneamente (sinergias). Este tipo de bioensayo es de relevancia ecológica, ya que monitoriza una interacción trófica en el primer nivel de la cadena alimenticia. Esto prueba que usa protozoos es el primero de este tipo que puede ser utilizado tanto para la detección de sustancias tóxicas bacterianas y para la evaluación del riesgo de las cepas bacterianas. Cepas y preparación de microorganismos. Las cepas utilizadas y sus fuentes se enumeran en la Tabla 1. Además de las cepas de referencia de colecciones oficiales de cultivo (American Type Culture Collection [ATCC], Rockville, Md .; Colección Nacional de Cultivos Tipo [NCTC], Londres, Reino Unido; y Deutsche Sammlung von Mikroorganismen [DSM], Braunschweig, Alemania), la mayoría de las cepas se originó a partir de los programas de cribado para el aislamiento de bacterias que producen sustancias antifúngicas o insecticidas, por ejemplo, Novartis Bactox Colección Seguridad de la Biotecnología [NBBC], Novartis Pharma AG, Basilea, Suiza). Se utilizó el CHA0 root-colonizar Pseudomonas fluorescens cepa (19), codificados NBBC 267, y así fueron algunos de sus derivados, que varían en la producción de metabolitos secundarios. Por ejemplo, P. fluorescens CHA0-Rif / pME3424 (12), codificados NBBC 268, contiene un plásmido responsable de la sobreproducción de la antibióticos 2,4-diacetilfloroglucinol y pyoluteorin. Todas las bacterias se cultivaron en medio de agar triptona soja a 25 ° C durante 3 días para permitir una comparación directa, aunque el uso de otros medios de comunicación podría influir en la producción de metabolitos bacterianos. Un asa 1-l de bacterias se resuspendió en 1 ml de agua del grifo estéril, lo que corresponde a un valor de McFarland de aproximadamente 5, o a una concentración de 10 8 a 10 9 células ml-1 (según lo determinado por la dilución y siembra en triptona agar de soja). Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio T. pyriformis GL (ATCC 30327) (3) se cultivó axénicamente a una densidad de aproximadamente 10 5 protozoos ml -1 en 1% de medio de proteosa peptona enriquecidos con extracto de levadura al 0,1% a 25 ° C en frascos de cultivo de tejidos. Los protozoos se centrifugaron a 200 xg durante 1 min. Se retiró el sobrenadante, y los protozoos se resuspendieron en (tamaño de poro 0,22-micras) a la membrana se filtró y se sometió a autoclave agua del grifo a una densidad final de 1 × 10 4 a 3 × 10 4 células ml -1. El número de células se midió con un contador de células CASY (Sistema Schaerfe, Reutlingen, Alemania) calibrado para una solución de NaCl 30 mM. Antes de que se añadieron las bacterias, los protozoos se incubaron a 25 ° C durante 30 min para adaptarlos a la presión osmótica inferior de agua del grifo antes del inicio del ensayo. Se filtra, se utilizó agua del grifo tratada en autoclave durante toda la prueba, porque imita mejor agua del grifo de la osmolaridad de los hábitats naturales de Tetrahymena y esterilización elimina el cloro residual. Si se requiere un mayor nivel de estandarización, sin embargo, el agua destilada modificado con bajas concentraciones de minerales ( "artificial" agua dulce) también se puede utilizar (20). Peptonas de medio de crecimiento de protozoos pueden reaccionar con metabolitos bacterianos y disminuir su toxicidad. Por lo tanto, la prueba debe realizarse sólo en agua dulce, incluso si T. pyriformis fácilmente ingiere bacterias en presencia de nutrientes disueltos. Se observaron respuestas más débiles o incluso falsos negativos cuando la prueba se llevó a cabo en el medio de crecimiento de protozoos. bioensayo estándar. El ensayo se llevó a cabo a 25 ° C en placas de poliestireno no tratados con superficie de 12 pocillos que permitieron conveniente examen microscópico repetitivo. a la que se añadió cada pocillo contenía 1 ml de suspensión bacteriana 500 l de suspensión de protozoo. El volumen total de 1,5 ml era lo suficientemente grande para evitar los efectos adversos de la evaporación durante el transcurso de tiempo del ensayo. Las concentraciones finales de microorganismos eran 3 x 10 4 ml -1 para T. pyriformis y 10 8 a 10 9 ml -1 para las bacterias. ingestión bacteriana y la lisis de protozoos se observaron en un microscopio invertido con un aumento de 125 veces. Toda la superficie de cada pocillo se controló después de 10 min y después de 2, 4, y 8 h. Cada cepa bacteriana se ensayó varias veces a fin de verificar la reproducibilidad de los resultados y la fiabilidad de la prueba. Una suspensión protozoo sin bacterias se usó como control para cada placa. Escherichia coli K-12 W3110 cepa (DSM 5911) o la cepa HB101 (DSM 1607) también se usan de forma rutinaria como un control negativo. P. fluorescens NBBC 267 y 268 NBBC fueron elegidos como cepas de referencia para los controles ligera y fuertemente positivas, respectivamente. La prueba BACTOX como una herramienta para el seguimiento de la toxicidad bacteriana. Varias bacterias fueron probados, y en algunos casos una lisis progresiva de los protozoos, que era una indicación clara de la toxicidad, se produjeron. En el caso ilustrado en la figura 1. lisis general requiere 10 min con la progresión presenta en la Fig. 1 a hasta d. Se necesita más tiempo para obtener la misma respuesta para las bacterias menos perjudiciales. Las observaciones microscópicas deben hacerse periódicamente con el fin de seguir la evolución de la población de protozoos, dado que los organismos protozoarios se lisan rápidamente canibalizado por los sobrevivientes y las proteínas liberadas pueden inactivar sustancias tóxicas. Aproximadamente el 10% de la población protozoo no ingerir bacterias. Como un procedimiento operativo estándar, sugerimos el seguimiento después de 10 minutos y después de 2, 4, y 6 a 8 h. Observaciones posteriores son innecesarios, ya que los efectos nocivos nunca han sido observados después de las 8 h. Con el fin de estimar la intensidad del efecto nocivo de las bacterias ensayadas, se determinó microscópicamente la proporción de protozoos muertos. Proponemos una escala fácil de juez, con puntuación de 1 a 5 como se muestra en la Fig. 2. Una escala más grande no sería apropiado para la sensibilidad de la prueba. Efecto de las bacterias nocivas sobre T. pyriformis. La lisis de los protozoos como se muestra progresivamente en los paneles A a D se produce más o menos rápidamente, dependiendo de la cepa bacteriana alimentados. Después de sólo 10 minutos de incubación con P. fluorescens NBBC 268, toda la población de protozoos estaba muerto (d). Las imágenes fueron producidas por Nomarski microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC). Escala para la cuantificación de la prueba BACTOX. Las diferentes etapas se corresponden con los siguientes efectos sobre la población de protozoos: 1, ningún efecto, es decir, el 100% de los protozoos son saludables; 2, débil, sólo unos pocos protozoos mirar deteriorado significativamente en comparación con el control; 3, fuerte, con aproximadamente 50% de los muertos protozoos; 4, muy fuerte, con sólo unos pocos protozoos que aún viven; y 5, el máximo, es decir, todos los protozoos están muertos. Las imágenes fueron producidas por DIC. Las respuestas típicas observadas con diferentes bacterias. Ejemplos de bacterias que causan diferentes niveles de efecto se presentan en la Tabla 2. No efecto detectable se observó con bacterias tales como E. coli K-12 o B o Lactococcus lactis. En el otro extremo de la escala, P. fluorescens NBBC 268 mató a casi todos los protozoos dentro de 10 min. Para tal efecto inmediato tenga lugar, hay que asumir que el metabolito activo (s) se disolvió en el medio de ensayo, ya que los protozoos no tiene tiempo suficiente para ingerir muchas bacterias. Otras bacterias necesitan unas pocas horas para desarrollar su efecto nocivo. Toxicidad que se desarrolla lentamente puede indicar que la sustancia tóxica es menos activo o se sintetiza en cantidades más pequeñas o que podría ser liberado o activado durante el proceso de digestión. Efectos de las cepas bacterianas tomadas como referencias y de varias concentraciones bacterianas en los protozoos una La sensibilidad de la prueba se evaluó con un total de 258 cepas; entre ellos, 106 cepas fueron activos (no se muestra). Pertenecían a bacterias Gram-positivas o gram-negativas de 22 géneros diferentes. La alta proporción de cepas activos obtenidos (41%) es una indicación de que la prueba es capaz de detectar diversas sustancias tóxicas y por lo tanto es aplicable a diversos tipos de bacterias. Se evaluó la toxicidad global de las bacterias a los protozoos y no la respuesta de protozoos a las toxinas específicas, ya que las bacterias comúnmente producen varias sustancias tóxicas al mismo tiempo. Las concentraciones aplicables de protozoos y bacterias. Era necesario evaluar el intervalo óptimo de concentración de los protozoos. Por encima de una concentración de 10 5 células ml -1. artefactos hacinamiento pueden influir en el resultado, y las densidades de células por debajo de 10 ml 3 -1 son demasiado bajos para una observación conveniente. Las variaciones entre estos límites de concentración no alteraron el resultado de los resultados de las pruebas. Por lo tanto, las mediciones altamente estandarizados de las densidades de células de protozoarios no son necesarios. Hemos investigado los efectos de diferentes concentraciones de bacterias sobre el resultado de los resultados de la prueba. Una cepa de E. coli inocua aplica en 10 o 100 veces la concentración estándar no produjo ningún efecto tóxico (Tabla 2). Un resultado falso positivo debido al hacinamiento en las altas densidades bacterianas por lo tanto se puede excluir. Por otra parte, un error que conduce a más de una concentración de 10 veces de bacterias no es realista, ya que la turbidez resultante sería hacer que la lectura de la prueba demasiado difícil. Una dilución de 10 veces de una cepa moderadamente tóxico que desarrolla su actividad durante el ciclo de digestión (por ejemplo P. fluorescens NBBC 267) no cambió el resultado. Esto podría ser debido a la conducta de alimentación, desde protozoos realizar un seguimiento de sus presas activamente y concentrarse en sus vacuolas digestivas. Una dilución de 10 veces de la cepa de acción rápida NBBC 268, sin embargo, se debilitó el efecto tóxico por dos niveles de la escala. Este resultado refuerza la hipótesis de que en este caso, la sustancia tóxica se disolvió en la solución. Para obtener la más alta sensibilidad, la prueba BACTOX debe llevarse a cabo a la concentración bacteriana óptima. La fiabilidad y la reproducibilidad de la prueba. Los niveles dados en la Tabla 2 son valores medios obtenidos a partir de varias repeticiones del experimento. Para todas las cepas bacterianas inocuas que mostraron un valor de 1, incluso después de 8 h de incubación, no se observaron niveles más altos de toxicidad durante al menos 10 repeticiones del experimento. Las variaciones entre los niveles de toxicidad observados durante las repeticiones del experimento fueron rara vez más de un nivel, y que se deben a diferencias tanto en las estimaciones visuales y en el tiempo que le tomó a los efectos nocivos para el desarrollo. Los resultados con las bacterias que pertenecen a diferentes grupos taxonómicos. La prueba se llevó a cabo con varios tipos de bacterias con el fin de evaluar su eficacia y para comparar los resultados con su clasificación en grupos de riesgo de peligro biológico (CCAA). Las cepas BACTOX-positivas se clasificaron en RG1 y RG2 de cualquiera de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) o la legislación Europea (UE). Algunos ejemplos relevantes se presentan en la Tabla 3. Los resultados de la prueba BACTOX con algunos grupos taxonómicos pertinentes de las bacterias a De acuerdo con su clasificación, los K-12 y B cepas de E. coli mostraron ninguna actividad, mientras que cuatro de cada cinco aislamientos de tipo salvaje hizo. No se detectaron cepas activas de las de calidad alimentaria bacterias L. lactis, pero todos los patógenos cepas de Staphylococcus aureus ensayadas fueron perjudiciales (Tabla 3). Las cepas del patógeno de insectos Bacillus thuringiensis altamente específico eran inocuas para Tetrahymena. y así eran las cepas de Bacillus cereus-intoxicación alimentaria. Esta última especie se clasifica en RG2 de la UE, pero las cepas analizadas no eran de origen clínico. Un número significativo de cepas clasificadas en RG1 UE y similares a los grupos biotecnológicamente importantes P. fluorescens y Streptomyces spp. presentado una actividad muy alta. La amplia gama obtenida en la escala de toxicidad en los grupos revela que la producción de metabolitos activos es más cepa específica de especies específicas. Por tanto, las propiedades tóxicas de cepas recién aisladas deben ser evaluados antes de crecimiento a gran escala (10), con el fin de determinar el nivel de bioseguridad adecuado de contención física. investigaciones del riesgo o medidas de seguridad adicionales a continuación, se pueden implementar para BACTOX-positivas cepas clasificadas en RG1 UE. BACTOX resultados negativos, sin embargo, no excluyen la posibilidad de efectos nocivos. Conclusión. Se presenta un nuevo tipo de prueba de bioseguridad basado en los protozoo T. piriforme. que no es comparable con otras pruebas de toxicidad. Permite el control de bacterias potencialmente peligrosas tomadas como tales en lugar de la monitorización de los productos químicos individuales. El organismo de prueba también es naturalmente bacteriotrophic, lo que hace que sea más relevante que las pruebas de toxicidad convencionales para los estudios de impacto ambiental que involucran bacterias liberadas de forma deliberada. Este ensayo se puede aplicar en la evaluación del riesgo de bacterias modificadas genéticamente o de tipo salvaje que pueden presentar propiedades tóxicas. EXPRESIONES DE GRATITUD Agradecemos a D. Haas, H. J. Halfmann, H. J. Kempf, U. Schnider, y K. Seeboth para proporcionar la amabilidad de bacterias; R. Peck para la cepa de protozoos; y C. M. Fischer para las correcciones. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (Prioridad Programa de Biotecnología, concesión no. 5.002 hasta 35.145) y por Novartis Pharma AG. NOTAS Recibido el 25 de septiembre de 1998. Aceptado 18 de marzo de 1999. ↵ * Autor para correspondencia. Dirección postal: Novartis Pharma AG, K-135.P.16, CH-4002 Basilea, Suiza. Teléfono: 41-61-696.58.01. Fax: 41-61-696.16.49. E-mail: pharma. novartis. com bernard. jenni. Referencias Baird D. J. Peluquería I. Soares A. M. V. M. Calow P. (1991) Una prueba primeras fases de vida con Daphnia magna Straus: una alternativa a la prueba de toxicidad crónica de 21 días? Ecotoxicol. Reinar. Saf. 22. 1-7. Benítez L. Martin-González A. Gilardi P. Soto T. Rodriguez de Lecea J. Gutiérrez J. C. (1994) El ciliado Tetrahymena thermophila protozoos como un biosensor para detectar micotoxinas. Letón. Appl. Microbiol. 19. 489-491. D. Borden Whitt G. S. Nanney D. L. 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